Sobota, 26 listopada 2022

11 szybkich porad dotyczących utrzymywania linii komórkowych ssaków

14 października 2022

Wykorzystanie linii komórkowych ssaków jest kluczowe w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych, zwłaszcza w przypadku nowych, bardziej adekwatnych modeli chorób stworzonych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Poniżej przedstawiamy kilka podstawowych wskazówek, które pomogą w hodowli linii komórkowych, niezależnie od ich źródła.

#1 - Uwierzytelnienie przed użyciem

W momencie otrzymania jakiejkolwiek nowej linii komórkowej ssaków, warto zweryfikować, czy komórki odpowiadają linii, którą mieliśmy otrzymać. Zawsze należy uważnie obserwować morfologię komórek po ich rozmrożeniu i posianiu, ponieważ będzie to dobry pierwszy wskaźnik, że coś jest nie tak. Przy zakupie linii komórkowej ważne jest uzyskanie Certyfikatu Analizy; jednak samodzielne uwierzytelnienie linii komórkowych przy użyciu metody opartej na DNA jest również konieczne, aby potwierdzić, że podane nam podwielokrotności nie są błędnie oznakowane, co jest możliwe nawet w przypadku dystrybucji przez sprzedawcę. Stworzenie profilu krótkich powtórzeń tandemowych z każdej linii komórkowej jest szczególnie przydatne, ponieważ pozwoli na rozróżnienie wielu linii komórkowych hodowanych w laboratorium. Kariotypowanie w celu zidentyfikowania składu strukturalnego chromosomów linii komórkowej jest również dobrym sposobem na upewnienie się, że nie doszło do niczego nadzwyczajnego, zwłaszcza w przypadku macierzystych linii komórkowych. W przypadku linii innych niż ludzkie można również zastosować analizę izoenzymów i typowanie mitochondrialnego DNA. Nowe linie komórkowe powinny być badane pod kątem skażenia mykoplazmą po wejściu do laboratorium, a jeśli to możliwe, przechowywane oddzielnie do czasu potwierdzenia, że są wolne od skażenia.

#2 - Przechowywanie jak największej liczby podwielokrotności

Jeśli stworzyłeś własną linię, powinieneś mieć około 10 do 20 fiolek z zapasem nasion zawierających 1-5 ×106 komórek każda, do których nie powinieneś mieć dostępu.1 Jeśli rozmnażasz linię komórkową z jednej lub dwóch fiolek z komórkami, zbanuj jak najwięcej fiolek o niskim pasażu i przygotuj zapas o numerze pasażu, z którym planujesz pracować. Konieczne jest wykonanie przybliżonych obliczeń, ile komórek z danego numeru pasażu możesz potrzebować w ciągu kilku miesięcy, ponieważ przeprowadzanie eksperymentów na komórkach z różnych pasaży może prowadzić do bardzo zmiennych wyników, w zależności od linii komórkowej i różnicy w numerze pasażu. Oceniając wcześniej swoje potrzeby eksperymentalne, będziesz wiedział, ile fiolek zapisać z każdego konkretnego numeru pasażu.

#3 - Zamrażaj komórki w odpowiednich warunkach

Czasami warto przetestować warunki mrożenia, zanim zaczniesz eksperymentować na swojej nowej linii komórkowej. Chociaż podłoże wzrostowe uzupełnione o 10% DMSO i 10% FBS jest jednym z najbardziej typowych rozwiązań do witryfikacji, nie zawsze jest odpowiednie. Zwiększenie procentu FBS, użycie glicerolu lub zakupienie pożywki witryfikacyjnej to inne opcje, ale nie będziesz wiedział, jak efektywnie przeżyją twoje komórki, dopóki nie spróbujesz ich zamrozić i rozmrozić przynajmniej raz lub dwa razy. Nawet jeśli polegasz na wcześniej napisanym protokole zamrażania, będziesz chciał się upewnić, że działa on prawidłowo.

#4 - Odpowiednio oznaczaj swoje linie komórkowe

Jednym z głównych winowajców błędnej identyfikacji linii komórkowych są źle oznakowane i trudne do zidentyfikowania probówki.1 Najlepszym sposobem identyfikacji probówek są etykiety z kodami kreskowymi, które zapewniają, że nigdy nie wybierzesz niewłaściwej probówki, dodając kolejną warstwę bezpieczeństwa przed każdą manipulacją. Stosowane etykiety powinny być dostosowane do środowiska, w jakim będą znajdować się komórki. W przypadku przechowywania kriogenicznego etykiety kriogeniczne oferują maksymalną odporność i nie zawiodą w wyniku zanurzenia w ciekłym azocie lub narażenia na ekstremalne zimno. Etykiety kriogeniczne powinny być przynajmniej oznaczone twoim nazwiskiem (lub inicjałami), nazwą linii komórkowej, datą obróbki i numerem pasażu.

#5 - Postępuj z komórkami konsekwentnie

Podczas obchodzenia się z liniami komórkowymi, upewnij się, że jesteś tak konsekwentny, jak to tylko możliwe. Podczas liczenia komórek używaj za każdym razem tej samej metody, niezależnie od tego, czy używasz hematytometru, czy maszyny do liczenia komórek. Podczas pasażowania komórek sporządź standardową procedurę operacyjną (SOP) i trzymaj się jej. Staraj się używać tego samego numeru pasażu dla każdego eksperymentu, aby zmniejszyć zmienność i nigdy nie pozwól komórkom rosnąć przez zbyt wiele pasaży (30-40 razy to maksimum dla większości linii, choć niektóre mogą starzeć się lub zmieniać swoje cechy znacznie wcześniej). W rzeczywistości najlepiej jest prowadzić ścisły rejestr wykorzystania linii komórkowych, najlepiej za pomocą systemu zarządzania informacją laboratoryjną (LIMS) i etykiet z kodami kreskowymi, aby można było zidentyfikować, kiedy i gdzie coś poszło nie tak.

#6 - Pracuj tylko z 1 linią w tym samym czasie

Zaleca się pracę z jedną linią komórkową w danym czasie w kapturze. Praca z więcej niż jedną linią grozi skażeniem krzyżowym linii komórkowych, które może być znacznie trudniejsze do wykrycia niż skażenie bakteriami lub grzybami, ponieważ komórki z dwóch różnych linii ssaków mogą wyglądać na nieodróżnialne od siebie.

#7 - Zarządzanie skażeniem

Mówiąc o zanieczyszczeniu, zawsze w twoim najlepszym interesie jest unikanie zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybowych w jak największym stopniu. Częste sprawdzanie komórek pod mikroskopem pomoże w tym, a w przypadku podłoży ze wskaźnikiem pH, nieoczekiwana zmiana koloru szybko ostrzeże cię, że coś jest nie tak. Niektóre podstawowe wskazówki dotyczące utrzymywania hodowli wolnych od zanieczyszczeń obejmują autoklawowanie wszystkich niesterylnych materiałów eksploatacyjnych, spryskiwanie wszystkiego, łącznie z samą szafką, 70% etanolem przed użyciem oraz dodawanie wybielacza do probówek lub płytek, które uległy silnemu zanieczyszczeniu. Środki czyszczące mogą być również dodawane do łaźni wodnych, a antybiotyki do samych hodowli (np. mieszaniny penicyliny i streptomycyny); jednakże konieczne jest przetestowanie tych środków, aby upewnić się, że nie są toksyczne i nie zakłócają właściwości linii.

#8 - Zastosuj odpowiednie środki ostrożności

Bezpieczeństwo ma kluczowe znaczenie podczas pracy z nową linią komórkową. Podstawowym zagrożeniem, które wiąże się z każdą nową linią jest ryzyko, że przenosi ona szkodliwego wirusa. Zaleca się, aby w każdym laboratorium pracującym z pierwotnymi materiałami ludzkimi cały personel był zaszczepiony na wirusowe zapalenie wątroby typu B. Niezależnie od tego, czyszczenie za pomocą środków dezynfekujących po zakończeniu pracy i unikanie bałaganu to jedne z najlepszych sposobów na zachowanie bezpieczeństwa. Zawsze upewniaj się, że pojemniki na odpady biologiczne nie są zbyt pełne; podnoszenie worków na odpady biologiczne ze zbyt dużą liczbą płytek grozi rozlaniem na podłogę, natomiast nieopróżnianie konsekwentnie pojemników używanych do aspiracji pożywek oznacza, że ciecz może w końcu zostać wessana do mechanizmu generującego ciśnienie w szafie biobezpieczeństwa, co ostatecznie może doprowadzić do zniszczenia samej szafy.

#9 - Szkolenie personelu w zakresie pracy z liniami komórkowymi

Nie wystarczy przeszkolić nowych pracowników w zakresie pracy z kulturami komórkowymi, a następnie pozwolić im na dowolne hodowanie linii komórkowych. Przeszkol ich, aby pracowali bezpośrednio z liniami komórkowymi, których będą potrzebować, podając wyraźne instrukcje dla każdej z nich, w tym jaki rodzaj podłoża należy zastosować, ponieważ może się ono różnić w zależności od linii komórkowej. Niektóre linie komórkowe mogą wymagać uzupełnienia aminokwasami, glutaminą lub pirogronianem. Ponadto, niektóre linie będą łatwo odłączać się od kolby, podczas gdy inne wymagają trypsyny lub małego stężenia EDTA. Nawet w przypadku prostych, łatwych do manipulowania linii warto upewnić się, że nowy personel dokładnie rozumie, kiedy i jak należy pasażować i obrabiać komórki.

#10 - Sprawdzanie jakości pożywek i surowic

Jakość pożywek i surowic może być trudna ze względu na zmienną naturę różnych partii. Zakup hurtowy jest tu pomocny, zwłaszcza w przypadku surowic, ponieważ można kupić jak najwięcej z jednej konkretnej partii, aby zapewnić spójne traktowanie komórek. Jeśli jesteś zmuszony kupić nową partię produktu, zawsze warto najpierw ją przetestować, mierząc takie cechy jak podwójny czas w stosunku do starej partii podłoża i/lub surowicy.

#11 - Bądź cierpliwy

Kuszące jest rozpoczęcie eksperymentów w momencie otrzymania komórek. W rzeczywistości, może to zająć trochę czasu, aby uzyskać dobre wyczucie tego, jak twoje komórki będą się zachowywać. Nie każdy alikwot jest równy, nawet jeśli źródło jest takie samo. Warto poświęcić czas na wdrożenie każdej strategii niezbędnej do utrzymania spójności i dokładności pracy.

LabTAG firmy GA International jest wiodącym producentem wysokowydajnych etykiet specjalistycznych i dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach.oraz dostawcą rozwiązań identyfikacyjnych stosowanych w laboratoriach badawczych i medycznych, a także w placówkach służby zdrowia.

Referencje:

  1. Geraghty RJ, Capes-Davis A, Davis JM, et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 2014;111(6):1021-1046.